用于显微镜的折射式自适应光学元件Refractive Adaptive Optics for Microscopy
自适应光学的英文名为Adaptive optics，简称 AO。 AO是指一系列强大的图像校正技术，已证实对多种生命科学显微镜的方法具有优势。然而，传统AO系统的额外复杂性和成本，使得自适应光学 (AO)无法在显微镜中的广泛应用。 德国Phaseform厂家开发了折射式、完全在线的AO系统，可以减少许多复杂的设置和降低成本。
在本应用说明中，我们探讨了我们的折射式AO概念如何增强显微镜能力，并通过宽视场AO荧光显微镜来展示这一点。
图1:油/水浸泡显微镜设置。
自适应光学AO在显微镜中的应用
人们常说，从显微镜到照相机和望远镜，光学成像系统的好坏取决于它们的光学性能。这可能是真的，但图像的好同时也取决于中间介质好，只有在中间介质允许的情况下，成像质量才会好。
在许多情况下，现代显微镜的性能，产生像差的来源有2个方面：其一是：被测样品和物镜之间的折射式率不匹配，导致球面像差。其二是：被测样品的形状以及折射式率的变化，导致依赖于样本本身的复杂像差。这种来着像差的“挑战”在单分子和深层组织的成像中更为严峻。如果不加以修正，它们会降低所获取图像的对比度和清晰度 [1-2]，阻止显微镜达到其理论分辨率。
在过去的二十年里，在显微镜中使用自适应光学的广泛研究已经证明了它的有效性。AO可以补偿像差并恢复显微镜的原始性能，而不受被测样品和样品架类型的影响，从而有助于放宽指数匹配标准并缩短被测样品制备时间。AO几乎适用于所有高级显微镜技术：共聚焦（confocal,）、宽视场（wide-field）、多光子（multi-photon）甚至超分辨率（super-resolution）方法，比如如 STED、SMS、STORM。特别是对于深层组织成像显微镜（一种独特地允许在自然环境中检查细胞的显微镜），AO可以在远低于被测样品表面的地方保持最佳分辨率。
自适应光学AO的商业化之路
在专业的天文学应用中，自适应光学AO子系统无处不在，但是AO自适应光学技术在显微镜应用中的发展很缓慢。这其中的主要原因是，相比于专业天文学，显微镜的成本较低，此外显微镜通常在尺寸上小得多，并且由折射式工作原理的透镜组成。
尽管如此，在最先进的显微镜领域一块，已经产生了第一个把商业自适应AO系统用于显微镜的解决方案。 它们作为显微镜扩展端口的附件。在内部结构中，他们通过将光瞳平面传递到可变形镜 (DM) 来执行波前测量和校正，并在校正后将光重新引导回显微镜的检测/成像路径。
但是，这些第一代产品需要仔细设置，不能普遍兼容，而且依然相对笨重。
图2:传统的自适应光学显微镜使用可变形的镜子来施加光路的折叠
图3:Phaseform为直接集成开发了完全在线自适应光学系统
Phaseform 全折射式AO显微镜
Phaseform 的愿景是让大多数显微镜用户都能使用自适应光学技术。 为了提供具有不妥协性能的集成、更紧凑的AO解决方案，我们认为，从反射波前调制到折射式波前调制的技术转变是必要的。因此，我们提出了一种专为显微镜设计的新型完全在线AO系统（图 3）。
Phaseform的AO显微镜是通过以下2点，优化了传统AO系统来实现的：
(A) 可变形反射镜替换成折射式DPP变形镜
(B) 省略波前传感器，改用像差估计算法。
折射式 DPP变形镜——自适应AO显微镜的关键技术
Phaseform相位调制变形镜DPP(Deformable Phase Plate)，如图 4 所示，是一种新型的动态光学元件。它的名字来自传统的变形镜，一种带有表面浮雕的透明材料薄板，用于补偿高级显微镜应用中的固定像差。然而，与那些不同的是，DPP 的表面可以通过跨越通光孔径的63个致动器阵列动态地塑造成任何任意形式[3]。 因此，它是可变形反射镜的折射式替代品。
图 4：折射式 63个致动器-相位调制变形镜DPP，能够校正径向7阶Zernike模式。
DPP相位调制变形镜 用于显微镜的主要优点是：
- 透射式：可以插入任何光路中，无需重新计算、重新成像或折叠光路。
- 尺寸紧凑：作为超薄透射元件，DPP变形镜 从系统的角度来看已经提供了空间节省，但其占用空间小，特别适合集成，甚至可以连续堆叠多次。
- 高效：它的操作与偏振无关，并且显示出有限的衍射损耗。
- 多功能：自动校正一阶和二阶球差和散光对于显微镜应用特别有用。 然而，更复杂的像差，例如在深部组织成像中由不同折射式率的区域导致的像差，需要更高阶的校正，DPP 可以提供，类似于DM。
- 动态：可以在高分辨率成像和显微镜设置中实时控制和操作DPP
无波前传感器的估算法SWE（Sensorless Wavefront Estimation）
光学像差的预知对其校正至关重要。 波前传感器，例如Shack-Hartmann传感器或干涉仪，通常用于经典AO系统中来测量动态像差。 然而，使用波前传感器一方面增加了AO系统的复杂性和成本，同时也不是一个实用的解决方案。尤其是对于显微镜应用，可能仅仅是因为显微镜设置的限制，甚至是由于所研究标本的性质而受限制。而SWE无波前传感器估算法（Sensorless wavefront estimation）是一个替代方案，可替代传统AO显微镜中的波前传感器，在这种情况下，像差动态是缓慢和相对小的。
SWE算法的两个一般要求是：
- 了解样本或成像目标，从而创建有效的品质因数，例如图像清晰度或对比度。这是基于针对波前调制器的不同布置对一系列捕获图像进行定量优化的实际像差估计，所必需的。
- 为所采用的波前调制器提供一个可预测的和稳健的控制方案。波前调制器需要放在几个精确的相对配置中，才能有效地实施任何 一种SWE 方法。PhaseformDPP的静电驱动原理和直观的控制算法特别适合此类任务[4-5]。
尽管SWE估算法的代价是增加了计算负载，牺牲了图像采集时间。但通过SWE大大降低了AO系统的硬件复杂性（如下面的案列展示）。此类方法的不同变体的优势已在许多高端显微镜模式中得到证明，例如共聚焦、双光子荧光、结构化照明、光片、STED 和 SMS [1-2]。
案例展示：即插即用自适应光学显微镜
DPP的传输工作原理与SWE相结合，使即插即用的AO系统成为可能。与安装在传统笼中的透镜类似，DPP可以插入显微镜的光路中，最小到零中断，以提供系统和样品引起的像差的动态校正。图5描述了Phaseform的Delta 7形式的DPP集成到商业(图5a和5b)和定制显微镜(图5c和5d)的4个示例。例子包括荧光宽视场和高端双光子显微镜成像深入到生物样品。SWE和DPP的传输特性使其易于集成为折光直列系统。
图5:商用和定制显微镜中基于dpp的AO系统的示例。(a)商用显微镜物镜和转塔之间集成的DPP。(b) DPP集成在商用显微镜的共轭瞳孔平面上，使用连接到相机端口的中继光学器件。(c)用于荧光宽视场成像的“世界上最小的AO显微镜”[5]。(d)将DPP集成到定制的双光子显微镜的照明路径中(与Prof。Alexander Jesacher，因斯布鲁克医科大学)[10]。
AO在显微镜中的优势如图6所示。描述了深入样品的双光子成像的实例结果，以及系统和样品诱导像差的波前无传感器补偿。左边的(a)列显示了在没有和有AO校正的情况下，对超过150 μm深的小鼠脑切片进行神经元成像的结果(与因斯布鲁克医科大学Alexander Jesacher教授小组合作)。柱(b)为球体样品40 μm深度成像结果。该实验是在与Prospective Instruments (Stefanie Kiderlen博士和Lukas Krainer博士)合作的双光子显微镜(MPX-1040)中安装DPP完成的。
图6:通过(a)定制和(b)商业获取的各种样品的图像(MPX-1040, Prospective Instruments)使用DPP进行无波前传感器AO校正的双光子显微镜。
结论
Phaseform认为，折射波前调制器和像差估计算法的最新技术进步将彻底改变自适应光学显微镜。我们设想一个未来，就像在天文学中发生的那样，自适应光学将成为每一台自建和每一台商用显微镜的默认配置。这个未来可能比我们想象的更近。
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TCSPC 在激光脉冲后的光子时间上建立光子分布
图1:二光子和三光子效率与脉冲持续时间的关系
商业生产复杂、高精度的HOEs和逼真的真彩全息图通常需要多个高功率激光光源。这些激光源必须提供完美的TEM00光束，足够优秀的波长和功率稳定性，长相干长度，必须能够适应环境条件 [3]。这种激光器在商业上是可行的，但是多光源的光学对准和光束路径管理困难且耗时。校准和组合激光光源的工作可能会分散人们对制作HOEs和全息图这一本来就很有挑战性的工作的注意力。为了使这些技术更加商业化，多色、共线性、高性能的激光组合器必须能够适应各种环境条件。一种专用的高功率激光组合器提供了经过验证的稳定性能，消除了这些困难，促进了HOEs制造工艺的开发和全息图曝光优化。
图1:用于全息的二极管泵浦固态激光器原理图(上)和模式抑制原理图(下)。 [3]
Argolight是一家法国的公司，专注于成像质量的控制，公司最初是为了解决NASA提出的请求，帮助他们保障国际空间站上的显微镜的准确性和可靠性，以达到验证显微镜质量且可以重复实验结果的目的。经过几年的努力，多代产品的更新，最终得到了NASA的认可，也亲眼见证了Argolight的产品搭乘着SpaceX的火箭，同宇航员一同进入了国际空间站。
Argolight的产品满足ISO 21073:2019 标准，该标准旨在用于评估共焦激光扫描显微镜图像性能的指标，用于荧光生物标本成像领域。并且积极与NIST合作，旨在为成像质量评估出一个标准。
接下来我们展示一个具体的Confocal.nl的案例，该案例使用 Argo-SIM 来展示其横向分辨率的优势。
使用 RCM1 技术以 60x 1.4 放大倍率获取的示例图像（2×2 拼接图像）。COS-7 细胞中的微管蛋白丝。 Andreas Kurz，德国维尔茨堡大学
Confocal.nl 使用 Argo-SIM 的荧光模式进行分辨率测量。 该图案呈现出成对的 36 μm 长线，其间距逐渐增加，从 0 到 390 nm，步长为 30 nm。存在四组线：一组垂直，一组水平，两组位于 + 和 – 45°
